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日 开花和夜开花烟草品种蜜腺中的花蜜糖调节和细胞壁转化酶

发布人: 索文龙 发布时间: 2018-08-01 点击: 136 来源: 种子工程技术中心

摘要:不 同物种之间的花蜜成分不同,通 常取决于开花时间和传粉类型。人 们已经构建出引起花蜜合成、分 泌的多种生化和分子机制模型。为深入了解这些机制,本 文对花蜜中己糖含量高低不同的昼开花和夜开花烟草品种进行了分析。昼 夜同时采集花蜜和蜜腺,测 定其可溶性糖和淀粉含量。同时,测 定蜜腺中细胞壁转化酶(CW-IVS)的活性和表达水平。结果表明,五 个烟草品种的蜜腺和花蜜中含有不同含量的蔗糖、葡萄糖和果糖。在 所有烟草品种的蜜腺中都检测到了细胞壁转化酶活性,其 可能在蜜腺组织和花蜜分泌过程中参与了蔗糖的水解。与夜开花品种相比,昼 开花品种的蜜腺和花蜜中蔗糖己糖比存在较大差异,是 因为夜开花品种蜜腺中蔗糖分解较高,而 昼开花品种则在花粉分泌过程中才出现蔗糖分解。然而,细 胞壁转化酶不是形成糖浓度差异的唯一原因,在 烟草品种的蜜腺中有部分糖是暂时以淀粉形式存储的。总之,夜 开花品种蜜腺中的淀粉含量要比昼开花品种的高。此外,夜 开花品种在上半夜当花蜜产量达到顶峰时,其淀粉含量有所下降。由 花蜜的蔗糖含量可以推算出蜜腺细胞质中的蔗糖浓度。昼 开花品种蜜腺细胞质中的蔗糖浓度约为花蜜中的两倍,而 在夜开花品种中情况恰恰相反,这 揭示了分泌机制的差异。在整个开花期,分 泌的花蜜糖始终保持稳定,这 表明没有出现分泌后修饰。根据获得的结果,我 们提出了昼开花和夜开花烟草品种花蜜糖分泌机制的适宜模型。

关键词:花蜜,蜜腺,细胞壁转化酶,烟草,糖组成,昼/

前言

花 蜜是一种富含糖的液体,大 多数被子植物都会产生用于完成许多功能,例 如吸引传粉者和防范食草动物(Brandenburg 等,2009González-Teuber Heil2009Adler 等,2012)。花 蜜是由蜜腺这一高度专化的腺体及周围组织产生并分泌的。烟草属中,所 有的花蜜腺都位于雌蕊的基部(Bernardello2007),蜜腺发育过程中因β-胡 萝卜素的产生而呈桔红色(Horner等,2007)。花 蜜的合成和分泌已经进行了大量研究,不 同的花蜜分泌生化和分子机制模型也已经被提出(Ge 等,2000 Horner等,2007 Kram 等,2009Mosti 等,2013Stpiczy´nska 等,2014)。但 由于开花植物的多样性,依 然有许多因素有待进一步的研究(Roy 等,2017)。一 个非常基础的花蜜分泌理论是从韧皮部到蜜腺表面的代谢物质外体运输(Vassilyev2010)。然而,韧 皮部汁液和花蜜之间的代谢物组成不同(Lohaus Schwerdtfeger2014),这 就无法支撑花蜜分泌的质外体运输理论。其 他假说提出多种酶和转运蛋白参与了花蜜生成。对于某些植物品种,提出了外分泌模式即 蔗糖从韧皮部传输到蜜腺薄壁细胞,在 蜜腺薄壁细胞中蔗糖快速转化为淀粉或直接运输到质外体。在这一转运过程中,位 于质膜的蔗糖转运蛋白SWEET9是必不可少的(Lin等,2014)SWEET9的 作用是蔗糖易化扩散转运蛋白,突变体缺少了SWEET9就不能产生花蜜,例如野生烟Nicotiana attenuataLin 等,2014)。蔗 糖一从蜜腺排出就立刻被胞外细胞壁转化酶(CW-INV)水解成葡萄糖和果糖(Ruhlmann等,2010)。在 提出的第三种分泌机制中,花 蜜代谢产物被运输到外部的蜜腺细胞,然后包裹进入囊泡内,与 质膜融合并将花蜜代谢物释放到蜜腺表面(Fahn1979ab)。这 三种花蜜分泌模型互不排斥,在 不同的植物品种中也可能存在花蜜分泌的其它方式。

在一些植物中,淀 粉在蜜腺中积累且在开花前约24小时达到顶峰,然后快速下降,这 是花蜜分泌前和分泌期间淀粉作为花蜜糖来源之一这一假说的根据(Nepi 等,1996Horner等,2007Ren等,2007ab)。淀 粉合成过程中编码同化酶基因在蜜腺发育早期有较高的表达,编 码降解酶基因则在蜜腺发育末期表达(Ren 等,2007a)。然而,荔枝(Litchi chinensis)花 蜜腺的研究表明其花蜜糖是由韧皮部汁液和蜜腺中的淀粉降解产物组成(Ning 等,2017)

在花蜜中发现的糖,最常见的是蔗糖、己糖、葡萄糖和果糖(Percival1961BakerBaker1983TiedgeLohaus2017)。鉴 于己糖通常不是韧皮部汁液的组分(LohausSchwerdtfeger2014),花 蜜中己糖的比例取决于蔗糖裂解酶是否存在及其活性。植 物中蔗糖裂解可以由至少两种类型的酶催化:蔗糖合酶(一种糖基转移酶)催化蔗糖的可逆裂解;蔗 糖转化酶催化蔗糖不可逆裂解,即催化水解。转 化酶存在于具有各种亚细胞定位和生化特性的多种异构体中(RoitschGonzález2004)。这些酶可分为三组:液泡转化酶(V-INVs),胞外转化酶(CW-INVs),中性转化酶(N-INVs)N-INVs需要碱性最佳pH值,V-INVs CW-INVs是所谓的酸性转化酶,因为它们在pH 4.5pH5活性最高。胞 外转化酶是非可溶性蛋白,以 离子键形式结合于细胞壁(Sturm1999)。每 个异构体都有一个单独的基因编码,这 就使这些异构体高度一致且具有共同的特性。

对于一些植物种类,例如胡萝卜(Daucus carota)和番茄(Solanum lycopersicum),酸 性转化酶在不同器官和不同发育阶段表现出特异性表达模式(Sturm等,1995GodtRoitsch1997)。通常情况下,在快速生长的组织中,随着己糖的需求增加,转 化酶的表达也不断增加(Weschke等,2003)。有趣的是,胡 萝卜和番茄都发现了酸性转化酶的mRNA在 花和花蕾的特异性表达(Lorenz等,1995GodtRoitsch1997)。推 测这种花特异性胞外转化酶对雌雄器官发育至关重要,例 如为花药供应碳水化合物(Dorion等,1996GodtRoitsch1997)。近年来,研究结果表明,CW-INV对 拟南芥花蜜分泌也起着关键作用(Ruhlmann等,2010)。发现拟南芥蜜腺中AtCWINV4的 表达较其它组织高度上调(Kram等,2009)。此外,在 整个拟南芥花中总的CW-IV活 性大大降低的两个独立的cwinv4突变株系不分泌花蜜,虽 然蜜腺超微结构与野生型植株相似(Ruhlmann等,2010)

烟 草属的花形态和授粉方式差异极大。在对20个烟草种研究中,测 定了几个昼开花和夜开花烟草种花蜜中的糖浓度(TiedgeLohaus2017)。烟 草属中有的品种蜜腺富含蔗糖,有 的品种蜜腺富含己糖,而 花蜜的确切成分取决于传粉类型、开花时间、花 冠长度及其它环境因素(TiedgeLohaus2017)。蔗糖己糖比范围在0.12.0,与 给定物种内的规律是相当一致的。

这 一发现提出了一个问题,即 花蜜中的糖成分是否是蜜腺中糖成分的结果。或者,花 蜜中蔗糖含量低可反映出蜜腺中和花蜜分泌过程中蔗糖酶活性高。此外,考 虑花朵开放和花蜜产生时间,我 们想要研究转化酶表达的潜在差异及在一天中的活性。除 了这些分泌前和分泌过程外,分 泌后过程也是引起糖组分变化的原因。在这种情况下,花 蜜本身必须含有蔗糖裂解酶。

为 进一步探索引起花蜜产生和分泌的机制,本 文研究了五个不同性状的烟草品种。其 中包括两个昼开花品种(N.tabacumN. africana)和两个夜开花品种(N.sylvestrisN.benthamiana)。每个类别中(昼或夜开花),又 各有一个品种蔗糖含量高,一个品种蔗糖含量低(图1)。这 些品种依靠白天活动的鸟类(N. africana:太阳鸟;N. tabacum:蜂鸟)、夜蛾授粉(N. sylvestris)或自花授粉(N. benthamiana)进行繁殖。此外,本文选择的N.attenuata品 种在晚上和早晨的黄昏时分开花,因 此对特定传粉者的依赖较少(KesslerBaldwin2007)。本 文研究了花蜜糖含量是否主要取决于前分泌过程,分 泌过程或分泌后修饰,在 每天的多个时间点比较花蜜糖和蜜腺糖;并且,测 定了转化酶活性及表达、记录分泌后活性。

 

材料与方法

植物材料

Nicotiana attenuataN.benthamianaN.africanaN.sylvestrisN.tabacum种子。每株烟用5L装 有堆肥土的盆于温室内盆栽,栽培条件是14h光照/10h黑暗,辐照度大约为300 µmol光量子m-2 s-1,温度设置白天25,夜间18

蜜腺和花蜜收集

蜜腺组织的每个样品(大约100mg)含有20-50个蜜腺,具体取决于品种。在每个时间点(2 p.m8 p.m2 a.m8 a.m)取三个样品。为了收集蜜腺,从花中获得雌蕊,用 解剖刀解剖蜜腺组织,用 超纯水漂洗除去表面的糖。所 有样品迅速用液氮冷冻,置于-80下贮藏备用。按 下面的公式计算单个蜜腺重量:

每个花蜜腺重量(mg)=100mg/每 个样品收集的蜜腺数。

每个品种,在四个时间点从3株中取至少3个花蜜样品。使 用微电极收集花蜜样品,参照TiedgeLohaus(2017)方 法进行微生物污染检测,-80贮藏备用。除此之外,还 要用光学显微镜检测花蜜样品排除花粉污染。用 于分泌后试验的花蜜样品则在室温下放置122448h。经 干燥后称重测定蜜腺和叶片含水量。计算方法如下:

水分含量=1-(干重/鲜重)。

蜜 腺和花蜜中糖和淀粉分析

用氯仿-甲醇-水 萃取法从蜜腺组织中提取可溶性代谢物(NadwodnikLohaus2008)。参照LohausSchwerdtfeger(2014)的方法,用HPLC分析花蜜、蜜腺和叶片中的糖。HPLC测定前过滤花蜜((0.2 µm硝酸纤维素滤膜)消除花粉污染。用80 mM NaOH洗脱离子交换柱(CarbopacTM PA10 4 mm ×250mm)。用 金电极脉冲安培检测器检测糖。脉冲设置为50700-800 mV对应持续400540540 ms。平 行测定糖标样作为外定标。使 用一个集成程序评价色谱图。用Riens(1994)改 进方法测定蜜腺中淀粉含量。

CWINV的表达

参照Logemann(1987)的方法并进行改进,从大约50mg的蜜腺组织中分离RNA,用 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)钝化核糖核酸酶活性,从而与RNA形 成不添加胍的复合物。用引物合成cDNA。设 计引物扩增不同烟草种的CWINV序列。将获得的序列克隆到pGEMR -T Easy载 体上用于测序并选择适用于定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)的特异性引物。通 过校正聚合酶扩增并与NCBI中已知序列进行blasting比 对验证所获得的引物和序列。用Maxima SYBR Green qPCR Master MixMx3005P qPCR System进行QRT-PCR分析。用 两倍稀释标准曲线的斜率计算PCRs的效率。每 个品种使用两个稳定的内参基因进行归一化处理(Vandesompele等,2002SchmidtDelaney2010Liu 等,2012)。用每个实验的第1个样品作为标准,被设定为1,后 续样品看作标准的相对表达水平。每个处理设置3个生物学重复,每个生物学重复测定2次。

CWIN、可 溶性酸性转化酶和中性转化酶的酶活测定

参照Wright(1998)方法从25mg蜜 腺组织中提取蛋白质。按照Heineke(1992)方法测定CW-INV活性。将 蛋白提取物等分加入到0.6 M蔗糖和pH 50.125 M乙酸钠中。用 可溶性蛋白组分测定可溶酸性转化酶和可溶中性转化酶活性。将 蛋白提取物等分加入到0.6 M蔗糖和pH 7.50.125 M乙酸钠中,10min后煮沸以停止反应,之 后用偶联酶法分光光度测定葡萄糖释放量。所有酶测定采用6个生物学重复,每个重复测定2次。用约5µL花蜜测定转化酶活性。

结果

光 照和黑暗期间花蜜和蜜腺中糖浓度

花 蜜和蜜腺中的糖组成主要有葡萄糖、果糖和蔗糖。在 所有样品中都未发现包括麦芽糖在内的其它糖。花蜜中总糖浓度在1042±863183±186 Mm,取 决于品种和收集时间(图2)。昼开花品种(N. africanaN. tabacum)在 白天花蜜含糖量最高,夜间持续下降。在夜开花品种中(N. benthamianaN. sylvestris),发 现在上半夜花蜜含糖量最低,但在后半夜浓度增加。昼夜开花的N. attenuataN.benthamiana类似(图2)。

通 过测定蜜腺中糖含量和含水量,也 可以测定蜜腺中的糖浓度。所 有品种蜜腺中的总糖浓度都低于花蜜,范围在72±6613±34 mM (2)。昼 开花品种花 蜜平均糖浓度大约是蜜腺糖浓度的3-5倍,夜开花品种和N. attenuata花 蜜平均糖浓度大约是蜜腺糖浓度的8-10倍。昼 开花品种蜜腺最大糖浓度出现在日间中间时段或结束时((2 8 p.m)。在昼夜开花品种N. attenuata也发现了同样的现象。在两个夜开花品种中,蜜 腺中糖浓度在夜间中间时段凌晨2点急剧增加。

烟 草品种的叶片也含有蔗糖、葡萄糖和果糖。光 照结束时叶片中的糖含量要高于夜晚结束时的糖含量,与开花时间无关。与花蜜和蜜腺相比,叶 片中的糖浓度明显较低(10–60mM)。这 些结果是从每克鲜重的含糖量和相应的含水量(78–94%)中获得的。

对 花蜜样品进行了微生物污染检测。然而,不 同的烟草品种都没有发现酵母或细菌污染,因 此可以排除外源微生物引起的花蜜糖分变化。

光 照和黑暗期间花蜜和蜜腺中糖成分

同 一品种三种糖的比例在不同的采集时间相对稳定,而 不同品种间糖的比例在某些情况下差异较大(图3)。在 花蜜和蜜腺中都观察到这种现象。一天的不同时段,N. africana花蜜中蔗糖百分率在3-8%N. attenuataN. benthamiana花 蜜中蔗糖己糖比较低,蔗糖百分率分别是6–9%10–13%N. tabacumN. sylvestris蔗糖的比例较高(16–23%42–49%)。总的来说,同 一品种的葡萄糖和果糖比例相似。

蜜腺中,同 一品种日间和夜间的糖分布相似。与花蜜相比,只有N. sylvestris是在凌晨2点 蜜腺中蔗糖含量较高,其 他所有烟草品种蜜腺蔗糖百分比全天都较高。N. attenuataN. benthamiana蔗糖百分比相对较低(10–28%),N. africanaN. tabacum中等(26–43%),N. sylvestris最高(26–56%)。

为 评估花蜜中给定糖的百分率增加是否也反映在蜜腺中,对 花蜜和蜜腺的糖含量进行了相关性分析。对于葡糖糖,没有发现相关性(Pearson’s r=0.191p = 0.420)。花 蜜和蜜腺的果糖和蔗糖百分率极显著或显著相关(果糖:Pearson’s r = 0.574, p = 0.008**;蔗糖:Pearson’s r = 0.481p = 0.032*)。

然而,在所有品种中,蜜 腺的平均蔗糖己糖比例高于花蜜(表1)。总的来说,昼开花品种(0.37 0.48)的 蜜腺和花蜜中蔗糖己糖比差异要比夜开花品种( 0.050.15)的大。

 

蜜腺中淀粉含量

蜜 腺中淀粉含量范围在0.9 ±0.1 mg g-1 FW20 ± 1.5 mg g-1 FW(图4)。夜 开花品种显著高于昼开花品种(p = 0.025)。在 光照和黑暗期间的最低淀粉量出现在昼开花品种和N. attenuata中。此外,在这些品种中,淀粉含量在夜晚较低,白天略高。在夜开花烟草品种中,发 现在早晨和傍晚其淀粉含量最高(图4)。在凌晨2点,夜 开花品种淀粉含量最低,同时其糖浓度最高。因 为植物中的淀粉是由葡萄糖合成,所 以检测了蜜腺中葡萄糖和淀粉含量之间是否存在相关性,但 是发现葡萄糖和淀粉含量,或果糖,蔗 糖和淀粉含量之间无显著相关性。

 

 

蜜腺中转化酶活性

蜜 腺中细胞壁转化酶在光照期和暗期都活跃。活性范围在0.003± 0.0010.059 ±0.004 U mg-1 FW(图5)。除了N. africana外,不管植株何时开花,所 有品种的最高酶活水平出现在光照期中间时段,随后活性下降。蜜腺中CW-INV活 性与蜜腺或花蜜中的糖组分无相关性。

 

叶片中CW-INV活性从0.003 ±0.0010.033 ± 0.004 U mg-1 FW(图3)。因此,活 性水平与蜜腺中的相似。叶片中CW-INV活 性在光阶段和黑暗期间的波动极其轻微。

蜜 腺中的可溶酸性转化酶在光阶段和黑暗期间也很活跃,其 平均活性水平略低于CW-INV活性的1/3。测定的活性范围在0.003 ± 0.0010.013 ± 0.007U mg-1 FW。日开花品种和N. attenuata在 光照中期其酶活水平最高,而 夜开花品种在黑暗中期其酶活水平最高。

不 同烟草种蜜腺中可溶中性转化酶活性非常低。测定的活性范围在0.0010.007 U mg-1FW,不 同品种或取样点之间无显著差异。

CWINV的表达水平

测定了5个烟草种蜜腺中CW-INVs的表达水平。因此,克隆每个种的CW-INV表达序列标签(EST)。设 计特异性引物用于定量RT-PCR。在 日开花和富含己糖的N. africana中,在整个光照和暗期CW-INV的 相对表达都非常稳定。在其他烟草种中,在 光阶段表达水平略高于黑暗期,不 受开花时间或花蜜中的己糖的百分比影响(图6)。在多数烟草种中,表 达水平的过程与转化酶活性一致,尤其是对于N. tabacumN. sylvestris(图6BE),其次是N. benthamiana(图6D)。转 化酶表达水平与蜜腺糖浓度的比较呈现不同的方式:在N.attenuata中,蜜 腺糖与表达水平相关性高,但不显著(葡萄糖:Pearson’s r = 0.913p = 0.458;果糖:Pearson’s r = 0.917p = 0.456;蔗糖:Pearson’s r = 0.917, p = 0.455)。在N.benthamiana中,负相关性高(葡萄糖:Pearson’s r = -0.887p = 0.469;果糖:Pearson’s r =-0.822p = 0.497;蔗糖:Pearson’s r = -0.963p = 0.437)。对于其它种,相关性普遍较低。

 

分泌后花蜜变化

为 检测分泌后花蜜糖组分变化,测 定了取样时样品及保存122448小时后样品的花蜜。结 果表明在这期间糖浓度变化不明显(图7)。轻 微波动可能是由用于HPLC测 定花蜜的高稀释系数(1: 2000)引起的。在 花蜜样品中未检测到转化酶活性。

讨论

花 蜜是由不同类型的蜜腺合成和分泌的。不 同品种的花蜜组分不同,可 能是为了配合不同类型的传粉者。到目前为止,导 致花蜜组分不同的花蜜产生和分泌植物特异性差异还不十分清楚。

花蜜糖分泌前的修饰

韧 皮部给蜜腺提供蔗糖(LohausSchwerdtfeger2014)。与 没有发现己糖的韧皮部汁液相比(Knop等,2001NadwodnikLohaus2008),除了蔗糖外,烟 草的花蜜中还含有大量的葡萄糖和果糖。花 蜜和韧皮部成分的差异可能是由蜜腺中花蜜分泌的代谢过程以及分泌后修饰过程引起的。为 了把这个问题搞清楚,本 文比较了花蜜和蜜腺中的糖组分。

对于夜开花烟草品种,发 现在上半夜时花蜜的糖浓度最低(图2)。这 可能是由于这一类品种的花蜜量在此时最高,因 此花蜜中的高含水量稀释了糖浓度。然而,对于昼开花品种,发现相较于白天,夜晚的糖浓度比较低,即 使白天的花蜜量最高,这 就违背了先前的假设。在晚上,韧 皮部运输降低到白天的40%左右(Riens等,1994),这 就意味着黑暗时传输到蜜腺的糖很少,这 也可能是花蜜糖浓度波动的原因。因此,昼 开花植物一般来说比较容易为它们的授粉者提供含营养的花蜜,因 为它们可以直接处理来自韧皮部汁液中的代谢产物;相比之下,夜开花植物,至少一部分,必须储存代谢物(图8)。该 发现与在昼开花和夜开花品种中观察到的淀粉含量差异相符合。总的来说,夜 开花品种蜜腺中的淀粉含量要比昼开花品种的高(图4)。此外,夜 开花品种在上半夜淀粉含量降低,同时花蜜量高。

淀 粉积累可能是开花前糖贮藏的一种形式(Weber等,1998),已 知开花前会出现淀粉降解以提供额外的糖(Nepi 等,1996Horner等,2007Ren等,2007b)。马铃薯块茎中,淀 粉含量降低是由蔗糖含量降低引起的(Hajirezaei等,2003)。本研究中,蜜 腺中淀粉和蔗糖或己糖之间没有整体相关性,但对于夜开花品种,淀 粉含量在半夜急剧减少,糖浓度显著增加。除此之外,蜜 腺和叶片之间的淀粉含量无相关性,因此,蜜 腺中的淀粉代谢似乎独立于植物的光依赖性淀粉代谢。

开花时,蜜腺糖的总浓度最高,所 以糖很可能是用于花蜜生产(图2)。蜜 腺和花蜜中的果糖和蔗糖的比例间高度相关。表明:花 蜜糖组分部分由蜜腺决定,且 仅在分泌过程中部分调节。对于葡萄糖,这种相关性较低。这 种现象可以通过以下事实来解释:一 部分葡萄糖转化为淀粉并储存在蜜腺中以备使用(Ren等,2007b)

花 蜜分泌过程中的调节

花 蜜中的糖浓度是整个蜜腺细胞的3-10倍。蒸 发引起的浓度增加可以被忽视,因 为被分析的植物有很长很窄的花柱,能保护花蜜不被蒸发(Plowright1987TiedgeLohaus2017)。这 表明活性糖运输可能通过单糖转运蛋白(MSTs)和/或蔗糖转运蛋白(SUTS)参与花蜜分泌。已 在拟南芥花中发现只运输葡萄糖而不是果糖的单糖/质子转运体(AtSTP1)Sherson等,2003)。在烟草中已经发现SUTs,在烟草花粉中发现NtSUT3 (Lemoine等,1999),但是截至目前,它 们在花和蜜腺中的出现和作用并不完全清楚。

一 类明显参与花蜜分泌的转运蛋白称之为SWEET蔗糖转运蛋白。在拟南芥和烟草中,SWEET9起 到蔗糖易化扩散转运蛋白的作用(Lin 等,2014),且有证据表明,与蔗糖吸收相比,这 种转运蛋白对蔗糖从蜜腺细胞流出更为重要。如前所述,昼 开花品种花蜜中的糖浓度是蜜腺细胞的3-5倍,夜开花品种是8-10倍。但是,迄今为止,关 于蜜腺薄壁细胞中糖的亚细胞分布的研究未见报道。假 设在蜜腺细胞中蔗糖的亚细胞分布与叶片中的分布相似(细 胞质中蔗糖含量高达50%Gaffa等,2007),且胞质腔室包含20%的蜜腺细胞,可 以推算出蜜腺细胞中的蔗糖浓度 (2,图3)。在昼开花品种中,蜜 腺细胞细胞质中蔗糖的最大浓度约为300–400 mM,花 蜜中的相应浓度约为100–300 mMN.attenuata中也得到类似结果。因此,蔗 糖易化扩散转运蛋白可能促进了蔗糖从蜜腺细胞流出(图8)。夜开花品种中,蜜 腺细胞的细胞质内蔗糖浓度大约在200 mM,花 蜜中蔗糖浓度大约为300–700 mM。在后一种情况下,来 自蜜腺细胞的蔗糖的易化扩散不可能进入到花蜜中。因此,不 排除蜜腺中不同细胞类型含有不同糖浓度的可能性,蔗 糖的易化扩散仅发生在特定蜜腺细胞内,而 在其它细胞中可能发生活性糖分泌。这 一发现与在拟南芥中的发现一致,其SWEET9位于蜜腺的基部(Lin 等,2014),从 这一领域的其它研究得出的结论,提 出了把蜜腺组织分成多个功能型子域(Roy 等,2017)

除了糖转运蛋白,转 化酶也似乎是花蜜代谢的一部分。为此,本文专门研究了CW-INV在蜜腺组织中表达。有关CW-IV表达的调控所知不多,但 在其它植物器官中已对该酶进行了研究。转 化酶表达受多因素调控,例如碳水化合物(Koch1996),植物激素(Wu 等,1993),生 物和非生物胁迫相关刺激((Roitsch等,2003)和蛋白质抑制剂(Krausgrill等,1996)。到目前为止,很 少有人研究蜜腺中花蜜相关转化酶表达是如何调控的。在N. attenuata发 现转化酶在早期花冠的部分区域高度上调,例如蜜腺,子房和花药。当开花持续直至成熟,转化酶表达降低(NaDHBrockmöller 等,2017)。大 多数花蜜是在早期开花过程中产生的,老 花有时根本没有花蜜。这一事实也表明,转 化酶在花蜜的生产中起着重要作用。对于其它烟草品种,目前还没有关于CW-INVs器 官特异性表达的数据。SturmChrispeels1990)发现在葡萄糖、果 糖或蔗糖上悬浮培养的胡萝卜细胞具有类似于β-呋喃果糖苷酶mRNA含量,在 葡萄糖上生长的细胞中mRNA水平略高(Roitsch 等,1995)。相比之下,不同β-呋 喃果糖苷酶基因的表达受葡萄糖抑制(Kunst 等,1974SarokinCarlson1984Martin等,1987)。对于烟草,这 种现象可能只适用于N.benthamiana,花 蜜糖与蔗糖酶表达水平之间呈极显著负相关。此外,高表达水平导致高CW-IV活 性也是可以预料到的。这似乎是真实的,尤 其是在花蜜中蔗糖含量高的品种(N.sylvestrisN.tabacum)。然而,出 现的转录后过程似乎阻止了整个转录物被转化为活性蛋白。

不同烟草种蜜腺中的CW-INV的活性(0.003-0.06 U mg-1 FW;图5))与 不同植物品种其它富含己糖的组织中测定的CW-INV的活性类似(Weschke等,2003)。此外,预 计花蜜中含有高浓度己糖的植物中转化酶活性增加(Ruhlmann等,2010)。然而,对于烟草,不 管品种富不富含己糖,所 得的数据都不能证实该假设。这 同样适用于液泡转化酶活性的变化。不 管品种富不富含己糖,昼 开花品种的液泡转化酶活性在光照阶段略高,夜 开花品种的液泡转化酶活性则在黑暗期略高。此外,由于活性低,中 性转化酶似乎对己糖产生的影响相对较小。同 时可能存在其它机制在糖组分中起作用,例 如植物体内蔗糖裂解酶的调控。除了蔗糖裂解酶,糖 类合成酶也可能参与了花蜜产生。已 知蔗糖磷酸合成酶在某些蜜腺中高度表达,且 其表达对花蜜产生至关重要(Lin等,2014)

对于本文所研究的5个烟草种,花 蜜中总糖浓度中的蔗糖比例始终低于蜜腺(图3),可能是由于CW-INVs引 起的蔗糖胞外水解造成的。昼 开花品种的蜜腺和花蜜之间蔗糖己糖比差异比夜开花品种的差异明显( 0.37–0.48 vs 0.05–0.15)。因此,分 泌期间蔗糖的分解在昼开花品种中必然更强(图8)。由 于蜜腺和花蜜中糖分的不同,尤其是昼开花品种,可以推测分泌过程中,不 论是通过糖的选择性运输还(或)是糖裂解酶(例如CWINVs)的活性,糖 成分至少部分地被修饰了。

分泌后修饰

本 研究在烟草品种中发现分泌后花蜜糖浓度无变化,花 蜜中未检测到转化酶活性。在acacia中,发 现转化酶引起明显花外花蜜的分泌后修饰(Heil等,2005)。也测定了Cucurbita pepo花蜜中转化酶活性,但 是活性太低以至于不能显著改变糖的组分(Nepi 等,2012)。尽管在N. attenuata花 蜜中检测到了其它的糖裂解酶,例如葡萄糖苷酶,但 到目前为止在烟草花蜜中未发现转化酶(Seo 等,2013)。这 意味着花蜜糖组分必须在分泌的最后阶段确定,而 不是进行分泌后修饰。

 

结论

花蜜糖的组成必须通过蜜腺中代谢过程及分泌期间代谢过程来确定(图8)。蔗糖是通过韧皮部运输到蜜腺。蜜腺内,蔗糖水解成己糖,一部分糖以淀粉的形式暂时储存直到开花,尤其是夜开花品种。开花期间,淀粉转化为了蔗糖和己糖。可能通过易化扩散转运蛋白(昼开花品种)或主动转运蛋白(夜开花品种)的作用,糖从蜜腺细胞中流出。在蜜腺组织以及在花蜜分泌过程中,通过CW-INVs,一部分蔗糖水解成葡萄糖和果糖,这就解释了为何花蜜中的己糖比例比蜜腺中的高。夜开花品种分泌前和昼开花品种分泌期间的蔗糖分解可能更高(可能是液泡转化酶的作用)。此外,花蜜中的糖组分不会出现分泌后修饰。然而,仅靠CW-INV无法引起己糖浓度的差异,因此,其它酶似乎在决定花蜜糖组成中起着重要的作用。

来源:Tiedge K and Lohaus G. Nectar Sugar Modulation and Cell Wall Invertases in the Nectaries

of Day- and Night- Flowering Nicotiana. Front. Plant Sci, 9:622. doi: 10.3389/fpls.2018.00622.

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